Colorante que tiñe estructuras basófilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromático (tiñe del mismo color que el del colorante, es decir azul) o metacromático (tiñe de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza química de la sustancia teñida.
Como colorante ortocromático, se usa frecuentemente para teñir tejido nervioso, donde tiñe la heterocromatina y los gránulos de Nissl (acúmulos de cisternas de retículo endoplasmático rugoso) de los somas neuronales, así como las fibras nerviosas amielínicas y células de glía. También se utiliza para la tinción de cortes semifinos.
El azul de toluidina tiñe metacromáticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparán sulfato, presente - por ejemplo - en el cartílago (condroblastos y matriz inmadura) y en los gránulos de las células cebadas.
Esta tinción utiliza la reducción de nitrato de plata, el cual se deposita sobre estructuras argirófilas. Puede usarse sola o en combinación con otras tinciones nucleares o citoplasmáticas.
Las estructuras argirófilas, como las fibras de reticulina (o reticulares). se tiñen de negro.
Esta técnica, de uso muy común, utiliza dos colorantes, que se aplican consecutivamente:
- Hematoxilina: este colorante catiónico (básico) se utiliza en primer lugar y tiñe sustancias que tenga grupos ácidos, tales como los grupos fosfato del ADN y a las proteínas nucleares que poseen carga negativa. Las estructuras que se tiñen con colorantes catiónicos, como la hematoxilina, se denominan basófilas. Este es el caso de la cromatina, por lo que los núcleos se tiñen con hematoxilina.
- Eosina: es un colorante débilmente aniónico (ácido), que tiñe estructuras ricas en grupos básicos, las cuales se denominan acidófilas (también eosinófilas cuando se tiñen con eosina), como las fibras de colágeno que se tiñen con la eosina de color rosa más o menos intenso.
Las coloraciones tricrómicas usan dos o más colorantes para teñir diferencialmente las diversas estructuras histológicas, según su basofilia / acidofilia o por su apetencia por un colorante específico.
El método del tricrómico de Goldner (también conocido como Masson-Goldner) usa hematoxilina de Groat y los colorantes rojo fucsina Ponçeau (xilidina Ponçeau, o Ponçeau 2R), naranja G (en solución de ácido fosfomolíbdico) y verde luz (solución acética).
La modificación de Goldner del método original de Masson tiñe las estructuras basófilas (como la cromatina) de color pardo-marrón a negro, las estructuras débil a moderadamente acidófilas de rojo a naranja y las fuertemente acidófilas, como las fibras de colágeno, de azul a verde.
Estos microscopios utilizan los cambios que suceden en la amplitud y la fase de onda de la luz que atraviesa la muestra para aumentar el contraste (diferencias de transparencia) entre los diversos componentes de la misma. Esto permite la observación de estructuras biológicas sin necesidad de teñirlas, por lo cual son muy útiles en la observación vital de células y tejidos, particularmente de cultivos celulares.
Se utilizan diversas técnicas para aumentar el contraste de los elementos de las muestras. El primero, denominado simplemente de contraste fases fue desarrollado por Zernike, se fundamenta en amplificar el retraso en la fase que ocurre en las ondas de luz cuando esta atraviesa objetos con diferentes índices de refracción.
Más recientemente se han desarrollado otros sistemas, tales como el de microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomasky, que utiliza luz polarizada, o los de modulación de contraste de Hoffman, que ilumina lateralmente a la muestra y genera imágenes (seudo)tridimensionales.
Este tipo de microscopía se fundamenta en la detección de la fluorescencia, la cual está formada por fotones (luz) con una longitud de onda dada, que es emitida por ciertas moléculas, denominadas fluorescentes. Cada molécula fluorescente emite una fluorescencia caracterizada por su color, es decir, por su longitud de onda. La emisión de fluorescencia sucede cuando las moléculas fluorescentes son excitadas por la incidencia sobre ellas de fotones (luz incidente o excitadora) con una longitud de onda característica y de mayor energía (más corta) que la de la fluorescencia emitida.
En Biología, la observación microscópica de la fluorescencia se suele realizar utilizando microscopios de epifluorescencia, equipados con un sistema de iluminación que permite que la luz incidente llegue a la muestra a través de los objetivos. Y también se requieren filtros que solo dejan pasar la fluorescencia de una determinada longitud de onda (color) hacia los oculares y el sistema de registro (cámara fotográfica o de vídeo) de la imágenes.
Actualmente, se suelen utilizar sistemas de microscopía confocal de fluorescencia, que utilizan un haz de luz incidente (excitadora) coherente, lo que permite escanear por planos la muestra y obtener imágenes de mayor resolución y sensibilidad a la fluorescencia a partir de muestras relativamente gruesas. Las imágenes obtenidas por planos (llamadas secciones ópticas) pueden apilarse informáticamente para obtener imágenes tridimensionales.
Las estructuras biológicas contienen muchas moléculas que son fluorescentes por si mismas (autofluorescentes), pero para detectar las que no lo son se utilizan moléculas fluorescentes, denominadas fluorocromos (como la fluoresceína y la rodamina), que se unen a ellas. Por ejemplo, los fluorocromos se pueden utilizar para marcar los anticuerpos que se utilizan en las técnicas de inmunofluorescencia, así como a otras moléculas biológicas que tienen afinidad por ciertos componentes celulares y tisulares, como es el caso de la faloidina, la cual se une a la actina permitiendo así su visualización. También son muy utilizados los fluorocromos que tiene afinidad por el ADN, como el DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro) o el yoduro de propidio, para visualizar los núcleos celulares.
Generalmente, cuando la muestra emite fluorescencia de dos o más colores, la adquisición de las imágenes se realiza secuencialmente, de forma que primero se registra un color, después otro y así sucesivamente, interponiendo los filtros adecuados. Las imágenes obtenidas del mismo campo, pero con diferente fluorescencia, se fusionan para obtener una imagen compuesta.
Los métodos histoquímicos utilizan reacciones químicas o propiedades físicas de los colorantes para revelar la presencia de compuestos orgánicos o inorgánicos en células y tejidos. Dependiendo de la naturaleza del compuesto a identificar se pueden utilizar cortes de muestras no fijadas, congeladas o fijadas e incluidas en parafina o resinas plásticas o en cultivos celulares.
La reacción del PAS revela la presencia de todo tipo de carbohidratos (polisacáridos, como el glucógeno, mucopolisacáridos, glucolípidos, glucoproteínas etc.).
Se fundamenta en la reacción con el reactivo de Schiff de los grupos aldehído liberados de los grupos vic-glicol presentes en los carbohidratos tras su oxidación con ácido peryódico. El reactivo de Schiff contiene fucsina básica (o pararrosanilina), que en solución ácida y en presencia de SO2 da lugar a una forma no coloreada (ácido N-sulfónico). Este reactivo reacciona con los grupos aldehído libres formando un compuesto insoluble de color púrpura. La técnica del PAS se puede utilizar sobre cortes obtenidos de muestras incluidas en parafina o criofijadas.
La reacción de Perl (o método Perl's) sirve para detectar la presencia de hierro que forma depósitos insolubles de hemosiderina en células y tejidos. Sin embargo, este método no detecta el hierro de la ferritina, que es hidrosoluble. Se utiliza sobre cortes de parafina o de congelación.
La reacción de Perls se fundamenta en la liberación de los iones férricos mediante la acción del ácido clorhídrico y su reacción con ferrocianuro potásico lo que da lugar a la formación de un precipitado azul verdoso de azul de Prusia (ferrocianuro férrico).
El método del Rojo-O al aceite sirve para visualizar los depósitos de lípidos que contienen la células en forma de gotas lipídicas (inclusiones).
Debido a que los lípidos son disueltos rápidamente por el alcohol durante el proceso de deshidratación, para su detección se utilizan cortes obtenidos por congelación.
El rojo-O al aceite pertenece al grupo de los lisocromos, sustancias capaces de disolverse en los lípidos y colorearlos. Los lisocromos no son colorantes en sentido estricto, sino que se trata de sustancias coloreadas, muy solubles en lípidos, solubles también en sustancias no liposolubles, como alcoholes de baja concentración, y que no se unen a otras estructuras tisulares. Para su utilización en la técnica histológica, estos productos se disuelven a saturación en alcohol al 50% o al 70%. Los núcleos pueden contrastarse con hematoxilina y el montaje de la preparación debe hacerse con glicerina-gelatina.
En la mayor parte de las técnicas histoenzimáticas, se emplean tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato, ya que el proceso de deshidratación e inclusión inactivaría los enzimas cuya presencia se quiere demostrar.
Las esterasas son un grupo de enzimas que hidrolizan esteres de ácidos carboxílicos, localizándose fundamentalmente en los lisosomas. Hay muchos tipos de esterasas distintas que actúan sobre diversos sustratos, pero cuyas actividades se solapan, ya que muchas de ellas son capaces de hidrolizar el mismo sustrato. Por ello, la subdivisión de las esterasas se basa en el tipo particular de éster que hidrolizan más eficientemente y en el efecto de diversos inhibidores enzimáticos.
La técnica utilizada en este caso revela todos los tipos de actividad esterasa ya que se emplea como sustrato un éster simple, el alfa-naftil acetato, por ello se denomina esterasa no específica. Los enzimas liberan el alfa-naftol que se revela con la sal diazoica pararrosanilina con nitrito sódico, por lo que las células con actividad esterasa aparecen de color marrón rojizo.
Las fosfatasas son un grupo de enzimas hidrolíticos que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre un sustrato determinado, por ejemplo la adenosina trifosfatasa, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos y su clasificación se basa en el pH al cual presentan una actividad óptima, diferenciándose dos grupos:
- Fosfatasas ácidas, que presentan actividad óptima a pH bajo (4,7 – 5,5).
- Fosfatasas alcalinas, que exhiben actividad óptima a pH elevado (8,3 – 9,4).
Las fosfatasas ácidas se localizan fundamentalmente en los lisosomas, mientras que la localización subcelular de las fosfatasas alcalinas no está clara.
Para la demostración histoquímica de ambos grupos de fosfatasas, se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato al pH correspondiente. El naftol liberado se demuestra con una sal de diazonio: pararrosanilina con nitrito sódico para la fosfatasa ácida (las células con esta actividad se tiñen de color rojo-anaranjado) y Fast Red TR para la fosfatasa alcalina (color rojo). Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina. En el caso de la fosfatasa ácida, los cortes se deshidratan, se aclaran y se montan con Entellán o DPX. Sin embargo, en el caso de la fosfatasa alcalina no es posible la deshidratación, por lo que las preparaciones se montan con glicerina – gelatina.
Las diaforasas son enzimas del grupo de las deshidrogenasas que catalizan la transferencia de electrones desde el NADH o el NADPH a otros aceptores. La técnica histoenzimática demuestra la presencia de la NADP - diaforasa utilizando NADPH como sustrato y la sal de tetrazolio NBT, que se reduce a formazán de color azulado, como aceptor para revelar la localización de esa actividad enzimática.
Las técnicas de inmunodetección (o inmunomarcaje) se fundamentan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, que permite la identificación de una proteína (el antígeno), cuya presencia queremos demostrar, mediante su unión a un anticuerpo específico (anticuerpo primario) contra ella. Según se empleen para identificar células o tejidos se suelen distinguir técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, aunque su fundamento es el mismo.
Es frecuente que esas técnicas utilicen el método de inmunodetección indirecta, que consiste emplear dos etapas para aumentar la sensibilidad de la detección. En un primer paso, se utiliza el anticuerpo primario que se une a su antígeno específico allí donde esté presente. En un segundo paso, se aplica otro anticuerpo (anticuerpo secundario) contra el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario está unido covalentemente a un marcador (se dice que el anticuerpo secundario está marcado) que permite su visualización. Este segundo paso permite amplificar el resultado de la reacción, ya que varias moléculas del anticuerpo secundario marcado pueden unirse a cada molécula del anticuerpo primario. Como consecuencia, el sitio donde está localizado el antígeno presenta más moléculas del enzima y así resulta una mayor sensibilidad a la detección.
Las técnicas de inmunodetección se pueden emplear en células aisladas y tejidos en los que la estructura del antígeno se haya preservado usando, por ejemplo, suspensiones celulares no fijadas o cortes obtenidos en criostato o fijaciones suaves con formol e inclusión en parafinas de bajo punto de fusión, para no desnaturalizar el antígeno.
Generalmente, los núcleos se contrastan con un colorante que no interfiera con la inmunodetección, bien con fluorocromos con afinidad por el ADN (por ejemplo DAPI) o colorantes para microscopía de campo claro, como la hematoxilina.
Según el tipo de marcador que se utilice, se distinguen los métodos de inmunohistoquímica:
- Inmunofluorescencia. Se utiliza como marcador un fluorocromo, como la fluoresceína, la rodamina , el Texas Red y otros. La visualización de los resultados se hace usando microscopía de fluorescencia y las estructuras que unen el anticuerpo primario muestran la fluorescencia emitida por el fluorocromo.
- Inmunoenzimática. Se utilizan enzimas como marcador, tales como la peroxidasa, cuya actividad se revela usando el método histoenzimático correspondiente, generalmente visible con microscopía de campo claro. las estructuras positivas para el anticuerpo primario aparecen teñidas con el color del revelador usado para detectar el producto de la reacción histoenzimática.
En la observación microscópica de cortes histológicos la imagen que se ve depende del plano en el cual fue seccionada la estructura original. Hay que tener en cuenta que, al cortar una estructura tridimensional, la orientación del plano de sección determina la forma del corte bidimensional obtenido sobre un porta.
Y cuando la estructura es heterogénea en su contenido (por ejemplo, contiene diversas capas o componentes) esa orientación y el nivel al cual se realizó la sección también determina cuales de ellos podrán verse en el corte.
Por tanto, es necesario conocer e indicar la orientación del plano de sección cuando se realiza la descripción microscópica de los cortes para poder interpretar correctamente la morfología y componentes de dicha estructura.
La inclusión de las muestras en resinas plásticas (como el Epon, la Araldita o similares) permite la obtención de cortes de grosor más delgado que en el caso de la parafina.
Aunque inicialmente esta técnica de inclusión se usó como un método para seleccionar regiones para la obtención de cortes ultrafinos para la microscopía electrónica de transmisión, hoy en día se utiliza frecuentemente para la microscopía la óptica.
El grosor de los cortes semifinos varía entre 0,5 y 5 μm y se tiñen con diversas técnicas como el azul de toluidina o la hematoxilina-eosina. Usando resinas de bajo punto de solidificación es posible realizar también técnicas histoquímicas y de inmunomarcaje.
La microscopía electrónica utiliza una fuente de radiación que emite un haz de electrones, cuya longitud de onda es mucho más corta que la de la luz visible, para "iluminar" las estructuras a observar. Eso permite obtener una resolución mucho mayor que con la microscopía óptica.
Como contrapartida, los electrones tienen un poder de penetración en los materiales, incluidos los gases, mucho menor que los fotones. Esto exige trabajar en alto vacío y una preparación particular de las muestras. Además, las imágenes que se obtienen solo proporcionan información en escalas de grises (aunque en algunos casos las imágenes pueden colorearse posteriormente usando escalas de falso color).
Las imágenes de la microscopía electrónica pueden formarse a partir de la información que portan dos clases de electrones que inciden en la muestra, lo que da lugar a dos tipos de microscopia electrónica:
Este tipo utiliza los electrones que atraviesan la muestra para formar las imágenes, lo que obliga a utilizar muestras extremadamente delgadas. En el caso de cortes de muestras biológicas, los cortes son ultrafinos y su grosor se encuentra entre 70 a 90 Å. Para obtenerlos las muestras se deben incluir en resinas plásticas (Araldita, Epon) lo suficientemente duras como para poder seccionarse tan delgadas.
En el caso de las muestras biológicas, dado que los electrones no proporcionan colores, se utilizan metales pesados para aumentar el contraste de los componente celulares y tisulares a los electrones. Fundamentalmente se utiliza osmio (tetróxido de osmio) para "fijar y teñir" las estructuras lipófilas, como las membranas celulares, y uranio (acetato de uranilo) para las proteínas y ácidos nucleicos.
La gran ventaja de la MET es alto poder de resolución, que se aproxima a los 0,2 nm (2 Å). Esto ha permitido observar y describir la estructura de los componentes y orgánulos celulares y de los microorganismos. Y, bajo ciertas condiciones, incluso la estructura de proteínas y de ácidos nucleicos.
Un método particular de la MET es la técnica de criofractura, en la cual se observan réplicas metalizadas de las muestras. Para ello, las muestras se congelan, se fracturan al golpearlas con una cuchilla y las superficies expuestas se recubren (sombrean) con una delgada capa de metal (generalmente platino). Las partes orgánicas se eliminan y la réplica metálica se observa al microscopio electrónico de transmisión.
Este método proporciona imágenes en relieve y es particularmente apropiada para la observación de las membranas celulares.
En este caso, para formar las imágenes se utiliza la información que portan los electrones que son emitidos por la muestra (llamados electrones secundarios) al incidir sobre ella haz de electrones de la fuente de "iluminación". Estructuralmente, esto permite obtener imágenes tridimensionales de la superficie de la muestra, con una gran profundidad de campo, pero no de su interior. Además, para minimizar las interacciones entre los electrones rebotados de diversas parte de la muestra (lo que produce imágenes borrosas), la "iluminación" de la misma se realiza haciendo un barrido (escaneo) secuencial de la superficie.
Dado que lo que interesa es que los electrones del haz interaccionen con la superficie de la muestra, en el caso de las biológicas no se requiere realizar secciones, pero se suele recubrir su superficie con una delgada (inferior a 10 nm) capa metálica, generalmente de oro, lo que facilita la emisión de electrones secundarios.
El poder de resolución del MEB es mucho menor que el de la MET, aproximadamente de 1 nm, pero se pueden conseguir los aumentos suficientes (en torno a x30.000) como para que sea de utilidad en el estudio de muestras biológicas, incluyendo los niveles citohistológicos.